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T4 DNA Ligase可催化dsDNA平末端或粘性末端相邻核酸的5'磷酸末端和3'羟基末端形成磷酸二酯键,还可催化RNA和双链中的ssDNA或RNA链连接,但不能催化全单链核苷酸连接。适用于标记RNA 3'-末端,环化RNA和DNA寡聚核苷酸以及克隆cDNA等核酸操作。
产品组分
酶活单位定义
在20 μl的连接反应体系中,6 μg的λDNA-HindⅢ的分解物在16℃下反应30 min时,有50%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
保存、运输条件
-20℃保存,≤0℃运输,避免反复冻融。
适用场景
Ø 克隆限制性内切酶生成的 DNA 片段
Ø 克隆 PCR 产物
Ø 将双链寡核苷酸连接子或接头与 DNA 相连
Ø 定点突变
Ø 扩增片段长度多态性 (AFLP)
Ø 连接酶介导的 RNA 检测(参见参考 3)
Ø 双螺旋 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交体中的缺口修复
Ø 线性 DNA 的自环化。
工作条件
Ø 在微量离心管中制配制连接反应体系:
a平末端载体与DNA片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。
b插入片段与载体的摩尔比应在3:1 - 10:1之间。
Ø 16℃过夜反应
Ø 连接产物转化
① 在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(如:DH5α Competent cell)。
② 取10 μl连接产物加入到100 μl感受态细胞中,轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀),冰上静置30 min。
▲注意: 连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10。
③ 42℃水浴热激45 sec后,立即置于冰上冷却2 - 3 min。
④ 加入900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素),37℃摇菌1 h(200 - 250 rpm)。
⑤ 将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。
⑥ 5,000 rpm(2,400 × g)离心5 min,弃掉900 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。
⑦ 37℃培养箱中倒置培养12 - 16 h。。
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