Oligo (dT)25 mRNA分离磁珠

适用范围

Oligo(dT)25磁珠通过磁珠表面的dT序列与mRNA的Ploy A尾部之间的碱基互补配对，被用于从多种样本中快速分离高度纯化完整的mRNA，如总RNA、粗细胞样本、动物组织、植物组织等，所有操作都在单管中一次完成，操作简单易行。分离的mRNA可直接用于大多数下游应用中，例如：cDNA文库构建、二代测序、RT-PCR、基因表达分析、体外翻译实验、引物延伸等分子生物学实验。

提取操作步骤

1.      推荐的缓冲液

2.      磁珠预处理

(1)    将磁珠瓶漩涡振荡 30 s，使磁珠充分重悬；

(2)    用移液器移取所需体积的磁珠至离心管中，置于磁力架中，磁分离，移去上清     液，从磁力架上取下反应管；

(3)    加入相同体积的结合缓冲液或者加入至少1mL以重悬浮磁珠，用移液器缓慢吹打 5~10 次或漩涡震荡 30 s；

(4)    将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

(5)    将洗涤过的磁珠重新悬浮在与步骤（2）中相同体积的结合缓冲液中，备用。

3.      从总RNA中纯化mRNA（以纯化75 μg Total RNA中mRNA 为例）

(1)    取 100 μL 含有 75 μg 的Total RNA 与 100 μL结合缓冲液混合。（若 Total RNA 含量低于75 μg/100 μL，直接混合；若 Total RNA 含量高于75 μg/100 μL，用 DEPC 处理过的水稀释至 75 μg/100 μL 后混合）；

(2)    65°C 孵育 2 min，打开 RNA 二级结构，结束后迅速置于冰上；

(3)    将 200 μL 混合液与 100 μL 洗涤后的磁珠在室温下旋转混合 3-5 min。 每 75 μg 总 RNA，使用 1 mg 珠子，磁珠应预先洗涤并重分散在 100 μL结合缓冲液中；

(4)    将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

(5)    取下离心管，加入 200 μL洗涤液B，小心吹打混匀；

(6)    将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

(7)    重复步骤 (6) 1 次；

注：洗涤需将磁珠彻底重悬，并在第二次洗涤后尽量去除干净上清。

(8)    根据后续实验，选择下列其一：

(9)    如不需要将 mRNA 从磁珠上洗脱下来，需用下游实验的酶缓冲液再洗涤磁珠一次。

(10)   如需从磁珠上洗脱 mRNA：添加 10-20 μL 无核酸酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5 )，吹打充分混匀，在 75℃ 至 80℃下孵育 2 分钟。然后将离心管放在磁力架上，将含有 mRNA 的上清液快速转移至新的 RNase-free 的离心管中。

4.      从动物/植物组织/培养细胞中提取mRNA

(1)  动物/植物组织的前处理

1)     将20-50 mg 动物组织、100 mg 植物组织在液氮中研磨成粉末，保持冷冻状态，避免 RNA 降解；

2)     将冷冻粉收集并转移到新的离心管中，添加 1mL裂解/结合缓冲液，匀浆器匀浆1-2 min至裂解完全。该步骤尽量快速操作，避免 mRNA 降解；

3)     在室温下以 14,000 rpm 离心 1 min，并将所有上清液转移至一个新的 EP 管。上清液可用于 mRNA 纯化，或保存在-80℃备用。

(2)  细胞悬浮液

1)     在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中洗涤细胞悬液，室温下以 4,000 rpm 离心 5 min 沉淀细胞并丢弃上清液；

2)     每 1-4×106 个动物或植物细胞加 1mL 裂解/结合缓冲液。用移液器吹打多次，裂解过程中 DNA 的释放会产生粘稠的溶液，从而确认完全裂解；

3)     通过 DNA 剪切降低粘度。使用 1-2 mL 注射器将裂解液通过 21 号针头 3 次。反复剪切可能会导致裂解液起泡，但不影响 mRNA 产量。离心30 秒可减少泡沫；

4)     裂解物可直接用于 mRNA 分离，或将其冷冻并保存在–80℃备用。

(3)  提取mRNA

1)     向清洗过的Oligo(dT)25磁珠中加入上述裂解物，混合均匀；

2)     室温旋转混合 5 min 进行结合。如果溶液粘稠，则增加结合时间；

3)     将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

4)     取下离心管，加入1 mL 洗涤液A，小心吹打混匀；

5)     将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

6)     取下离心管，加入1 mL 洗涤液B，小心吹打混匀；

7)     将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附，保持样品管在磁力架上静止，用移液枪吸取上清并弃掉，操作过程中避免触碰到磁珠团；

8)     根据后续实验，选择下列其一：

a如不需要将 mRNA 从磁珠上洗脱下来（如后续进行固相 cDNA 合成），请用500 μL洗涤液B 再洗涤一次，然后用下游实验中使用的酶缓冲液洗涤一次。

b 如需从磁珠上洗脱 mRNA：添加 10-20 μL 无酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5 )，吹打充分混匀，在 75℃ 至 80℃下孵育 2 分钟。然后将离心管放在磁力架上，将含有 mRNA 的上清液快速转移至新的 RNase-free 的离心管中。

注意事项     

为了获得良好的mRNA，有必要通过创建无核糖核酸酶的环境来最小化 RNase 的活性。为避免污染，应采取以下预防措施：

1.     操作人员应全程佩戴一次性手套。操作中若接触未经DEPC处理的玻璃器皿等物品，要及时更换手套。

2.     应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，离心管和枪头等塑料器皿也应该使用 DEPC处理后，灭菌使用。

3.     配制相应的试剂应使用经0.1%的DEPC 处理过的水。Tris和DTT不能经过 DEPC 处理，因为 Tris 会使 DEPC 失活。在添加 Tris / DTT 之前，溶液应经过 DEPC 处理和高压灭菌。加入 Tris 后，溶液应再次高压灭菌。