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Oligo (dT)25 mRNA分离磁珠
适用范围
Oligo(dT)25磁珠通过磁珠表面的dT序列与mRNA的Ploy A尾部之间的碱基互补配对,被用于从多种样本中快速分离高度纯化完整的mRNA,如总RNA、粗细胞样本、动物组织、植物组织等,所有操作都在单管中一次完成,操作简单易行。分离的mRNA可直接用于大多数下游应用中,例如:cDNA文库构建、二代测序、RT-PCR、基因表达分析、体外翻译实验、引物延伸等分子生物学实验。
提取操作步骤
1. 推荐的缓冲液
2. 磁珠预处理
(1) 将磁珠瓶漩涡振荡 30 s,使磁珠充分重悬;
(2) 用移液器移取所需体积的磁珠至离心管中,置于磁力架中,磁分离,移去上清 液,从磁力架上取下反应管;
(3) 加入相同体积的结合缓冲液或者加入至少1mL以重悬浮磁珠,用移液器缓慢吹打 5~10 次或漩涡震荡 30 s;
(4) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
(5) 将洗涤过的磁珠重新悬浮在与步骤(2)中相同体积的结合缓冲液中,备用。
3. 从总RNA中纯化mRNA(以纯化75 μg Total RNA中mRNA 为例)
(1) 取 100 μL 含有 75 μg 的Total RNA 与 100 μL结合缓冲液混合。(若 Total RNA 含量低于75 μg/100 μL,直接混合;若 Total RNA 含量高于75 μg/100 μL,用 DEPC 处理过的水稀释至 75 μg/100 μL 后混合);
(2) 65°C 孵育 2 min,打开 RNA 二级结构,结束后迅速置于冰上;
(3) 将 200 μL 混合液与 100 μL 洗涤后的磁珠在室温下旋转混合 3-5 min。 每 75 μg 总 RNA,使用 1 mg 珠子,磁珠应预先洗涤并重分散在 100 μL结合缓冲液中;
(4) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
(5) 取下离心管,加入 200 μL洗涤液B,小心吹打混匀;
(6) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
(7) 重复步骤 (6) 1 次;
注:洗涤需将磁珠彻底重悬,并在第二次洗涤后尽量去除干净上清。
(8) 根据后续实验,选择下列其一:
(9) 如不需要将 mRNA 从磁珠上洗脱下来,需用下游实验的酶缓冲液再洗涤磁珠一次。
(10) 如需从磁珠上洗脱 mRNA:添加 10-20 μL 无核酸酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5 ),吹打充分混匀,在 75℃ 至 80℃下孵育 2 分钟。然后将离心管放在磁力架上,将含有 mRNA 的上清液快速转移至新的 RNase-free 的离心管中。
4. 从动物/植物组织/培养细胞中提取mRNA
(1) 动物/植物组织的前处理
1) 将20-50 mg 动物组织、100 mg 植物组织在液氮中研磨成粉末,保持冷冻状态,避免 RNA 降解;
2) 将冷冻粉收集并转移到新的离心管中,添加 1mL裂解/结合缓冲液,匀浆器匀浆1-2 min至裂解完全。该步骤尽量快速操作,避免 mRNA 降解;
3) 在室温下以 14,000 rpm 离心 1 min,并将所有上清液转移至一个新的 EP 管。上清液可用于 mRNA 纯化,或保存在-80℃备用。
(2) 细胞悬浮液
1) 在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中洗涤细胞悬液,室温下以 4,000 rpm 离心 5 min 沉淀细胞并丢弃上清液;
2) 每 1-4×106 个动物或植物细胞加 1mL 裂解/结合缓冲液。用移液器吹打多次,裂解过程中 DNA 的释放会产生粘稠的溶液,从而确认完全裂解;
3) 通过 DNA 剪切降低粘度。使用 1-2 mL 注射器将裂解液通过 21 号针头 3 次。反复剪切可能会导致裂解液起泡,但不影响 mRNA 产量。离心30 秒可减少泡沫;
4) 裂解物可直接用于 mRNA 分离,或将其冷冻并保存在–80℃备用。
(3) 提取mRNA
1) 向清洗过的Oligo(dT)25磁珠中加入上述裂解物,混合均匀;
2) 室温旋转混合 5 min 进行结合。如果溶液粘稠,则增加结合时间;
3) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
4) 取下离心管,加入1 mL 洗涤液A,小心吹打混匀;
5) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
6) 取下离心管,加入1 mL 洗涤液B,小心吹打混匀;
7) 将离心管置于磁力架上 1 min左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团;
8) 根据后续实验,选择下列其一:
a如不需要将 mRNA 从磁珠上洗脱下来(如后续进行固相 cDNA 合成),请用500 μL洗涤液B 再洗涤一次,然后用下游实验中使用的酶缓冲液洗涤一次。
b 如需从磁珠上洗脱 mRNA:添加 10-20 μL 无酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5 ),吹打充分混匀,在 75℃ 至 80℃下孵育 2 分钟。然后将离心管放在磁力架上,将含有 mRNA 的上清液快速转移至新的 RNase-free 的离心管中。
注意事项
为了获得良好的mRNA,有必要通过创建无核糖核酸酶的环境来最小化 RNase 的活性。为避免污染,应采取以下预防措施:
1. 操作人员应全程佩戴一次性手套。操作中若接触未经DEPC处理的玻璃器皿等物品,要及时更换手套。
2. 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h,离心管和枪头等塑料器皿也应该使用 DEPC处理后,灭菌使用。
3. 配制相应的试剂应使用经0.1%的DEPC 处理过的水。Tris和DTT不能经过 DEPC 处理,因为 Tris 会使 DEPC 失活。在添加 Tris / DTT 之前,溶液应经过 DEPC 处理和高压灭菌。加入 Tris 后,溶液应再次高压灭菌。
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